核酸药物研发平台_纳米递送系统_药效学评价-美迪西生物医药

热门核酸药物种类

ASOsiRNA mRNA Aptamer

核酸药物的优势
核酸药物基于碱基序列快速直观的设计，利用简单的制备原料和工艺，可负担的生产成本，让药物研发的周期大幅缩短，让药物定制或个性化治疗方案成为可能，使罕见病等困扰目前医药行业的棘手问题得以解决。
核酸药物合成&修饰
合成
◆ 核苷酸单体合成
◆ 寡核苷酸合成
◆ 递送系统合成
◆ 寡核苷酸偶联物合成
修饰
◆ 糖修饰
◆ 碱基修饰
◆ 骨架修饰
◆ 递送系统修饰
美迪西核苷酸药物化学合成平台可以一站式提供单体合成、修饰；寡核苷酸合成；递送系统合成以及寡核苷酸偶联物的合成。已经建成的siRNA库，不仅有丰富的单体库存，而且拥有庞大的单体合成砌块库，可以快速完成各类修饰单体的合成。美迪西拥有专业的小核酸药物的研发团队可以提供高效快捷地研发服务；已有多个siRNA药物FTE项目完成和进行中。
生物活性评价
◆ siRNA-GALNAc与靶向肝细胞的结合评估（ELISA,SPR,FP,FACS,MSD,Confocal 显微镜）
◆ 靶标mRNA/蛋白质水平降低评估（RT/Q-PCR,Western blot)
◆ 细胞表型和功能性干扰的评估（细胞增殖，迁移，蛋白质修饰和互作）
◆ 脱靶效应评估
◆ 在数据库寻找潜在的脱靶off-target mRNA和蛋白（数据库如NCBI/nucleotide BLAST)
◆总体分析脱靶现象(RNAseq or RNA Microarray)
核酸药物CMC研究
寡核苷酸药物开发过程中药学方面的挑战主要是寡核苷酸大规模生产能力和分析与质控能力要求高，大规模生产对单体原料，设备，合成工艺及纯化方面都有很高要求。制剂方面的挑战在于制备LNP（GalNac技术的小核酸除外）的难度高；分析方面挑战在于寡核苷酸的有关物质与活性成分本身的结构相似性大，质量研究与控制需要多原理不同手段的分析方法进行，除了一般注射剂研究外还要进行LNP的包封率测定等。美迪西在siRNA等寡核苷酸药物方面的CMC服务项目已启动。
核酸药物工艺开发
起始物料选择：易采购、低毒性、质量稳定的原辅料和试剂选择；核酸工艺开发：低成本、高安全性、质量稳定的绿色生产工艺；质量控制：先进的质量控制体系，完善的质控技术标准；工艺放大：端到端深度对接，平稳转移。

核酸药物制剂服务

脂质及其衍生物凭借其低免疫原性、生物相容性及对寡核苷酸分子较高的包封率成为近年来备受关注的核酸药物的新型递送系统，系统中的脂质可以在生理环境下带有正电荷，通过静电作用将带有负电荷的核酸分子包裹起来，并帮助整个载体系统与靶细胞的细胞膜相结合，从而起到递送作用。
图片来源：Science China Life Sciences volume 62,pages333-348(2019)
常见脂质递送系统
美迪西经常使用纳米粒子制备方法
成功RNA递送系统的特征
递送系统的设计依靠化学修饰手段可以实现，合成途径不复杂，便于生产；有靶向的递送，递送的靶向和脱靶比率要在可接受的范围。靶向和脱靶递送需要同时使用生物分布和功能化指标来衡量，因为95%的RNA可能被保留在内体(endosome)中，生物分布并不见得能够预测RNA的功能性递送。发生疗效的RNA剂量必须显著低于可能发生毒性的剂量；药物的活性应该在不同批次之间保持一致;在大多数临床环境下，重复给药不会导致疗效或安全性的丧失。

美迪西纳米递送系统研究体系

核酸-脂质系统研究

• 处方：药脂比研究、溶剂筛选、水相：有机溶剂比例研究等；

• 工艺：制备方法；

• 稳定性：溶液状态初步稳定性；

• 剂型筛选。

核酸药物生物分析

药代、毒代分析

• 分子杂交-酶联分析（H-ELISA) LC-MS/MS ；

• 分子杂交-电化学发光分析（H-ECL）；

• 反转录荧光定量PCR（RT-qPCR）；

• 定量PCR(qPCR)；

• 数字微滴PCR(ddPCR)。

免疫原性分析

• 总抗药物抗体即ADA分析；

• MSD ；

• 中和抗体（Nab)分析：CLBA or Cell-based Assay。

PD或TOX相关细胞因子和生物标志物

Cytokine&Biomarker(细胞因子或生物标志物）

• Singleplex（基于各种LBA技术）；

• Multiplex(Luminex、MSD、FACS CBA技术）；

• FACS。

美迪西案例：Compound A –siRNA plasma quantification (20 µL plasma)

生物分析三大技术平台

LC-MS/MS/HRMS技术平台
高特异性灵敏度：可达ng级别优势：可监测代谢产品
Hybridization-EIA/ECL技术平台
灵敏度：可达pM级优势：多变的标记策略、个性化的反应策略
qPCR/ddPCR技术平台
高特异性灵敏度：可达1个log级别内的拷贝数优势：更灵敏

核酸药物药效学评价

寡核苷酸药物开发过程中药效学方面的挑战包括：靶向不足导致靶部位的寡核苷酸药物浓度低导致给药剂量不断增高；寡核苷酸药物与非靶 RNA 结合引发的脱靶毒性等。

美迪西案例：核酸药物药效学评价

◆ 不同用药途径的比较（如静脉注射，瘤内局部注射）

◆ 体内药效与靶标mRNA/蛋白质降解（PD）和寡核苷酸药物的系统暴露量（PK）的相关性分析

• Animals: Female BALB/c Nude mice；

• Cells: MDA-MB-231, 5x10⁶/mouse；

• Model Establishment: Right flank SC injection；

• Treatment: IV injection;

TIW (three times a week);

Group3, 4: mRNA (LNP)group.

• Animals: Female BALB/c Nude mice；

• Cells: MDA-MB-231, 5x10⁶/mouse；

• Model Establishment: Right flank SC injection；

• Treatment: Intratumor in-jection;

TIW (three times aweek);

Group 7, 8: mRNA(LNP) group.

◆ 脂质纳米粒（Dendrimer LNP）

◆ (递送和NIR影像，Luc mRNA;Ⅳ and intra-tumoral)

◆ 外泌体（CNP-generated exosome)

◆ （脑胶质瘤导向外泌体Exo-T递送PTEN mRNA,IV）

同源小鼠模型

Cancer Type	Cell Lines
Bladder Cancer	MB49
Brain Cancer	G261
Breast Cancer	4T1, EMT6, JC,EO771
Colon Cancer	CT26.WT, MC-38, Colon26
Leukemia	C1498, L1210, WEHI-3
Liver cancer	H22, Hepa 1-6
Lung Cancer	LLC1, KLN205
Lymphoma	A20, EL4, L5178-R, E.G7-OVA
Mastocytoma	P815
Melanoma	B16-F10, Clone-M3
Myeloma	J558
Pancreas Cancer	Panc 02
Renal Cancer	RENCA

Luciferase Cell Line

G261-luc, 4T1-luc, Mc38-luc, H22-luc, B16-F10-luc, LLC1-luc

人源化小鼠模型

Cancer Type	Cell Lines in PBMC or HSC CD34+ Humanized Mice
Brain Cancer	U-87 MG
Breast Cancer	HCC1954, MDA-MB-231, JIMT-1
Colon Cancer	HT29, LoVo, Ls174T, HT-15
Gastric Cancer	NCI-N87, NUGC-4
Leukemia	THP-1
Lung Cancer	HCC827, NCI-H1975, NCI-H292, A549
Lymphoma	Raji, TMD8, MOLM-13
Melanoma	A375
Myeloma	RPMI-8226, NCI-H929, MM.1S
Ovarian Cancer	OVCAR-3
Pancreatic Cancer	Capan-2
Renal Cancer	786-O
Skin Cancer	A431

核酸药物药代动力学研究

寡核苷酸药物开发过程中药代动力学PK方面的挑战也是此类药物较大的难题。未经修饰的寡核苷酸类药物成药性不佳；PK特性差；稳定性差；容易被核酸酶降解；分布特性差；和靶标的结合力不佳；生物分析方法开发难度大等。
通过化学修饰和递送系统可以解决这些问题。随着技术突破，部分难题目前得到较好的解决办法，其中化学修饰可以避免核酸类药物被核酸酶降解并延长半衰期，高效安全的递送系统可以使寡核苷酸类药物精准的靶向器官，比如肝脏，并提高细胞摄取效率，使寡核苷酸类药物发挥较好的治疗功能。寡核苷酸药物从转录后水平进行治疗，能针对难以成药的特殊蛋白靶点实现突破，有望攻克尚无药物治疗的疾病包括遗传性疾病和其他难治性疾病。
美迪西具备完善的寡核苷酸生物分析平台、肝脏活体穿刺、肌肉活检和鞘内注射平台用于PK和PK/PD研究。
美迪西食蟹猴B超引导下肝脏活体穿刺平台能够最大程度地避开大血管及胆囊，具有创伤小、穿刺操作安全简便、定位准确、术后恢复较好等优势。
B超引导下肝脏活体穿刺平台可实时动态显示活检针进针取材的全过程，提高穿刺成功率和实验结果的准确性，同时也促进了实验动物福利的完善，已经多次应用于基因治疗药物的临床前体内PK和PK/PD评价项目，并在同一个体动物上不同时间点实现连续采集多份肝脏样品。
同时，食蟹猴肌肉活检平台同样可实现在同一个体动物上连续采集多份肌肉样品；对于神经系统治疗药物，局部鞘内注射平台实现局部治疗，都能够为基因疗法和核酸药物临床前PK和PK/PD评价提供有力支持。
2022年7月8日线上研讨会《助力扬帆，核酸药物新时代启航》是你核酸药物研发前行路上不可错过的可靠向导。这是一场干货满满的知识盛宴，是一场关乎核酸药物未来的头脑风暴，更是一场值得每一位医药人士参与的惊喜约“会”，快来观看视频回放吧。
视频回放：【核酸药物研发专题研讨会】破局核酸药物研发，迎接核酸药物新时代
2023年1月5日，美迪西药代动力学及生物分析部主任蒋品博士做客美迪西云讲堂直播间，根据美迪西 DMPK 部门的试验经验，分享一些不同类型创新药的DMPK研究案例，讲解这些药物在研发过程中的DMPK要点，希望对关注DMPK的各位研究者有所帮助。欢迎观看视频回放。
视频回放：【云讲堂】PROTAC和寡核苷酸类药物研发的DMPK要点

FAQs

核酸药物为什么值得研发？

若想成为新兴药物，都应满足以下几个特点，核酸药物也不例外：
1. 有市场；
也就是说，要有用药的需求。目前有7,000多种罕见病，其中约80%是单基因异常，半数病例为儿童，95%尚无治疗手段。而核酸药物由于其独特的物理化学和药理学特点，在治疗罕见病上优势明显。
2. 有特色；
最好具有不可替代的作用。当前核酸药物治疗主要有三个方向：导入正常基因以补充因基因突变而失去的功能，通过RNA干扰抑制或沉默异常基因，通过基因编辑直接纠正异常基因结构。这些都是核酸药物的独特治疗方式。
3. 有成功案例；
这有助于提高药物研发的效率和成功率。已有多款核酸药物获批上市，还有更多核酸药物正在临床试验中。
4. 有一定技术难度；
这有助于推动创新技术的发展和药物的更新换代，保证药物的久永生命力。核酸药物的递送系统、目标核酸选择和制备等，都涉及先进的生产或实验技术。
核酸药物的分类有哪些？

如果按照结构来划分，核酸药物可以分为DNA药物和RNA药物。进一步细分就有反义寡核苷酸、小干扰RNA（siRNA）、小RNA、短发卡RNA（shRNA）、信使RNA（mRNA）、质粒DNA、适配体、核酶及脱氧核酶等。
质粒DNA目前在兽用疫苗中应用最为广泛，而人用产品还主要停留在临床试验阶段。
小核酸药物siRNA和ASO的区别主要有哪些？

1、化学结构的区别
ASO是单链，而siRNA是双链。
2、作用机制的区别
ASO或通过RNase H降解靶mRNA，或通过空间位阻干扰mRNA功能，siRNA则主要通过RISC复合体降解mRNA。
3、发挥药效的细胞空间
RNase H在胞质和胞核中均有分布，因此ASO可以在胞质和胞核中发挥作用。然而，RISC仅存在于胞质中，故siRNA仅在胞质中发挥作用。
4、药效作用持久性以及是否可以放大
RISC可反复作用于靶标mRNA，因此siRNA的药效更为持久。
此外，siRNA的正义链在被释放或降解后，可作为引物，在RNA依赖的RNA聚合酶的催化下，以靶mRNA为模板扩增得到dsRNA。dsRNA随后被Dicer降解成新的siRNA，进入RNA干扰循环，从而实现药物效果的级联放大。
核酸药物的优缺点有哪些？

优势:
（1）研发周期短、靶点筛选快；
（2）治疗领域广；
（3）不易发生耐药性；
（4）效果持久；
（5）研发成功率高。
劣势:
（1）药物本身无靶向性；
（2）在人体内不稳定、易被清除。
siRNA药物非临床安全性特点

• siRNA药物会呈现靶mRNA被沉默后的生物学效应，由此引发的其他效应是可能的，但一般不易观察到。
• 由于siRNA核酸序列设计的专一性，与非靶mRNA结合的效应很少见。
• 由于RISC作用的高效性，较少见到siRNA抢夺其它miRNA资源的情况。
• 很多毒性反应与siRNA药物在给药部位、组织、细胞残留或畜积相关，例如给药部位的炎性反应、肝细胞空泡变性、肾小管空泡变性及嗜碱性颗粒沉积等。
• 还有一些毒性反应是与siRNA药物排泄过程相关。
• siRNA具有诱发先天性和获得性免疫反应的潜能，但在常规非临床安全性研究中，这种效应通常不明显。
• 虽然可能会出现免疫原性，但抗原不一定就是siRNA本身。制剂辅料或结构组分也可能引起免疫反应，例如，如果含有PEG（聚乙二醇），则容易发生抗PEG抗体。

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